Влияние гуминовых кислот на функцию и структуру щитовидной железы кур-несушек в условиях отравления свинцом

Сахин А., Искендер Х., Терим Капакин К.А. и др. (Турция)
Sahin A., Iskender H., Terim Kapakin K.A., Altinkaynak K., Hayirli A., Gonultas A. and Kaynar O. The effect of humic acid substances on the thyroid function and structure in lead poisoning//Braz. J. Poultry Sci. – 2016. – V. 18, No 4. DOI: 10.1590/1806-9061-2016-0266.

Свинец (Pb) – тяжелый металл, отрицательно влияющий на функцию и структуру щитовидной железы ЩЖ. Гуминовые кислоты (ГК), благодаря своей высокой молекулярной массе и обилию функциональных групп, могут хелатировать многие тяжелые металлы. Задачей нашего опыта было изучение профилактического эффекта ГК на уровни тиреоидных гормонов и гистопатологическое состояние ЩЖ у кур-несушек в условиях отравления свинцом. После недели адаптационного периода 192 головы 25-недельных несушек Lohmann White были разделены на 4 группы, с 12 повторностями по 4 головы на каждую группу, каждую повторность содержали в отдельной клетке. Контрольная группа получала основной рацион (ОР), опытные группы получали тот же рацион с добавкой ГК (0,15%), свинца (0,3 г/кг) или с обеими добавками сразу. Отравление свинцом на оказывало влияния на концентрации трийодтиронина (FT3; 3,22 ± 0,20 нг/дл) или тироксина (FT4; 0,71 ± 0,08 нг/дл), однако на 167% увеличивало концентрацию тиреостимулирующего гормона ТСГ. Добавка ГК снижала повышенный в ответ на отравление свинцом уровень ТСГ до нормального уровня. У несушек, получавших свинец, отмечены дегенеративные изменения в эпителиальных клетках ЩЖ. В межфолликулярном пространстве присутствовали клетки соединительной ткани, отмечены значительные количества коллоида с частично атрофированными фолликулами. При параллельном вводе в рацион ГК эти гистопатологические симптомы были менее выраженными. Сделан вывод, что ГК смягчают влияние отравления свинцом на функцию и структуру ЩЖ, возможно, за счет снижения его усвоения железой за счет хелатирования, а также за счет противовоспалительного эффекта ГК.

ВВЕДЕНИЕ

Щитовидная железа (ЩЖ) опосредует различные метаболические процессы в организме, секретируя тиреоидные гормоны, прежде всего, тироксин (Т4) и трийодтиронин (Т3). Эти гормоны являются производными аминокислот и образуются при йодировании тирозиновых остатков молекул тиреоглобулина. Они отвечают за регуляцию общей метаболической активности организма. Секреция тиреоидных гормонов контролируется тиреостимулирующим гормоном (ТСГ), выделяемым гипофизом. Повышение функциональной активности ЩЖ приводит к гипертиреоидизму, тогда как снижение – к гипотиреоидизму (Szkudlinski et al., 2002), причем в развитии обоих этих синдромов могут играть роль факторы среды, физиологического статуса и генетики (Burger, 2004). Одним из важнейших средовых факторов, ухудшающих функциональное состояние ЩЖ, является отравление тяжелыми металлами (Cullent et al., 1984).

Свинец (Pb) является одним из важнейших тяжелых металлов, этот элемент токсичен и не является незаменимым для организма. Урбанизация населения и индустриализация экономики привели к усилению риска отравления населения этим металлом (Smith, 1984; Roper, 1991; Tong et al., 2000). Этот элемент широко распространен в природе и используется во многих областях промышленности, например, в производстве аккумуляторных батарей, некоторых красок, стекла, стройматериалов, агрохимикатов, косметических средств, топливных присадок (Elwood et al., 1984). Попадая различными путями в организм, свинец накапливается в органах и тканях. В крови 85-90% свинца связывается с эритроцитами, а остальные 15-10% — с белками плазмы крови (Lyn Patrick, 2006). Отравление свинцом приводит к возникновению различных гематологических, неврологических и иммунологических патологий, биохимическим изменениям, дисфункции печени и почек, нарушению метаболизма глюкозы (Al-Saleh, 1994; Lavicoli et al., 2003). Отравление свинцом негативно сказывается и на эндокринных железах, особенно на гомеостазе тиреоидных, репродуктивных и стрессовых гормонов (Zacharewski, 1998).

Для лечения отравлений свинцом используются различные агенты, хелатирующие этот элемент. Гуминовые кислоты (ГК) – группа водорастворимых веществ, включающая, в частности, гуминовые, фульвовые и ульмовые кислоты, и образующаяся в гумусе, продукте распада органических веществ в почве (Islam et al., 2005). Ранее было показано, что ГК могут смягчать отклонения в нормальной секреции тиреоидных гормонов и действовать как иммуномодуляторы (Laurberg et al., 2003). Считается, что благодаря высокой молекулярной массе и обилию в молекулах ГК функциональных групп их ввод в рационы может снижать негативные последствия отравлений эндокринных органов тяжелыми металлами за счет их хелатирования (Schnitzer and Khan, 1972; Fan et al., 2004). Данный опыт был проведен с целью определить профилактический эффект ГК на гормональные и гистопатологические изменения в ЩЖ кур-несушек, индуцированные экспериментальным отравлением свинцом.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

Птица, рационы и схема опыта

192 головы 25-недельных несушек Lohmann White были в случайном порядке разделены на 4 группы.

За 1 неделю до начала опыта по кормлению всю птицу кормили одинаковым основным рационом (ОР), аналогичным опытным рационам по содержанию энергии и азота в соответствии с нормами NRC (1994). Затем птицу контрольной группы К кормили тем же ОР; птицу группы ГК – тем же ОР с добавкой 0,15% смеси ГК, содержащей 50,6% гуминовой кислоты и 9,4% фульвовой кислоты (препарат Farmagülatör ХР, Farmavet International, Стамбул, Турция); группа С получала ОР с добавкой 0,3 г/кг свинца (тригидрат ацетата свинца, Acros Organics, Нью-Джерси, США); в группе С+ГК в ОР вводили обе эти добавки одновременно.

Каждая группа (48 голов) была разделена на 12 повторностей по 4 головы в каждой, содержащихся в отдельных клетках (42 х 48 см). Кормление экспериментальными рационами продолжалось 10 дней. Во время адаптационного и опытного периодов световой режим был 17С:7Т; корм и свежую воду давали вволю.

Взятие образцов крови и их биохимический анализ

В конце опыта у одной случайно выбранной курицы из каждой повторности брали образец крови из крыловой вены (всего по 12 образцов от каждой группы) в специальные пробирки для забора крови. Образцы центрифугировали (1500 g в течение 15 мин), полученную плазму отбирали в пробирки Eppendorf. Образцы плазмы по 250 мкл инкубировали со смесью 2 мл 30% азотной кислоты (Merck-KGaA, Дармштадт, Германия) и 3 мл 70% перекиси водорода (Berghoff, Энинген, Германия) в течение 25 мин в установке для микроволнового разложения Microwave Digestion System (Berghoff, Энинген, Германия). Затем определяли в образцах содержание свинца методом эмиссионной масс-спектроскопии с индуктивно-связанной плазмой (Optima 2100 DV, ICP/ OES, Perkin-Elmer, Шелтон, Коннектикут, США). Кроме того, определяли концентрации в плазме Т3, Т4 и ТСГ с помощью автоматического диагностического анализатора (Modular Analytics Evo, F. Hoffmann-La Roche Ltd., Берлин, Германия).

Гистопатологическое исследование

После взятия у отобранных особей образцов крови их убивали путем смещения шейных позвонков для взятия на исследование щитовидной железы. Образцы ткани ЩЖ фиксировали в 10% забуференном формалиновом растворе и затем парафинировали. Срезы (по 5 мкм) окрашивали гематоксилин-эозином и затем изучались под световым микроскопом с использованием методов окрашивания по Массону (трехцветного) и надйодной кислотой и реагентом Шиффа.

Статистическая обработка полученных данных

Полученные данные анализировали методом однофакторного вариативного анализа по алгоритму PROC GLM (SAS, 2002). Достоверность различий между средними по группам величинами оценивали по методу Фишера (минимальных достоверных различий); различия считались статистически достоверными при р≤0,05. Представленные в таблицах данные представляют собой средние по группам показатели, рассчитанные по методу наименьших квадратов (LSM), ± стандартная ошибка средней (SEM).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Концентрации свинца и тиреоидных гормонов в плазме крови

Данные по концентрации свинца и тиреоидных гормонов в плазме крови представлены в Табл. 1. Ввод свинца в базовый рацион привел к 3,73-кратному достоверному повышению его концентрации в плазме по сравнению с контролем (р<0,0001). При одновременном вводе в рацион ГК концентрация свинца в плазме достоверно снижалась на 16,5% по сравнению с группой, получавшей только свинец (р<0,05).

Таблица 1. Влияние ввода в рацион ГК на фоне 10-дневного отравления свинцом на концентрации в плазме крови свинца и тиреоидных гормонов

Цифры в строках, помеченные разными буквами, различаются достоверно, р<0,05.

Концентрация свободного Т4 (0,71 нг/дл) и соотношение концентраций свободных Т3:Т4 (5,49) были близкими во всех группах. Отравление свинцом (группа С) привело к достоверному повышению концентрации ТСГ в 2,67 раза (р<0,05), а при одновременном вводе в рацион свинца и ГК она возвращалась к уровню контроля.

Гистопатология щитовидной железы

В тканях ЩЖ кур контрольной группы выраженных гистопатологических изменений обнаружено не было (Рис. 1). В группе, получавшей свинец, в эпителиальных клетках ЩЖ отмечены дегенеративные изменения и некротические зоны различной интенсивности (Рис. 2А). Наблюдалось повышение числа клеток соединительной ткани в межфолликулярном пространстве и числа участков коллоида с атрофированными фолликулами. Кроме того, наблюдалась инфильтрация мононуклеарных клеток (прежде всего, лимфоцитов) в паренхиму, капсулу и окружающую ее жировую ткань (Рис. 2В).

У кур группы С+ГК отмечены аналогичные гистопатологические изменения, однако менее интенсивные. В 3 образцах отмечено исчезновение фолликулярной структуры и распространение коллоида в паренхимальную и межфолликулярную области (Рис. 3А). В других образцах повреждения были менее выраженными, и фолликулы имели практически нормальный вид (Рис. 3В).

Рисунок 1. Срез нормальной ЩЖ (группа К), окрашенной гематоксилин-эозином.



Рисунок 2. Дегенеративные изменения в ЩЖ при отравлении свинцом (группа С). Видны остатки разрушения клеток и некротические зоны (см. стрелку на рис. А), а также инфильтрации лимфоцитов (см. стрелку на рис. В).


Рисунок 3. ЩЖ в группе С+ГК. Отмечены потеря фолликулярной структуры и распространение коллоида по паренхимальной и межфолликулярной областям (см. стрелку на рис. А), или восстановление структуры железы (см. стрелку на рис. В).

ОБСУЖДЕНИЕ

Свинец является одним из самых вредных тяжелых металлов и может накапливаться в мягких (напр., печени, почках) и твердых (напр., костях) тканях организма (Lyn Patrick, 2006; Gillis et al., 2012). Отравление свинцом приводит к структурным и функциональным изменениям во многих органах: дисфункции почек, нарушениям функции нервной системы и метаболизма глюкозы, дисфункции печени, гематологическим изменениям (Al-Saleh 1994; Lavicoli et al., 2003). В частности, свинец может вызывать анемию, снижая концентрацию гемоглобина в кровотоке (Hilliard et al., 1973; Lynch et al., 1976).

Свинец входит в некоторые агрохимикаты, используемые в растениеводстве, поэтому им могут быть заражены многие компоненты кормов для птицы. Свинец может накапливаться в организме птицы, создавая угрозу ее здоровью и ухудшая биологическую безопасность птицепродуктов. В нашем опыте был выбран уровень свинца в корме 0,3 мг/кг, который не вызывает гибели птицы, однако является для нее токсичным при скармливании в течение 10 дней (Vangris and Mare, 1974). Действительно, случаев гибели птицы в опыте не было отмечено, хотя повышение концентрации свинца в плазме крови было высокодостоверным (см. Табл. 1). Наблюдалась также связь между концентрациями в плазме свинца и гормонов ЩЖ (Табл. 1).

Свинец оказывает негативное влияние на синтез, секрецию и биологическую активность тиреоидных и стрессовых гормонов, а также на связанные с этими гормонами метаболические реакции (Zacharewski, 1998). В нашем исследовании отравление свинцом оказывало некоторое влияние на концентрации в плазме тиреоидных гормонов (Табл. 1), возможно, связанное с дозой и продолжительностью скармливания курам свинца. Ранее Ibrahim et al. (2012) сообщали, что скармливание ацетата свинца не вызывает достоверных изменений концентраций в плазме Т4 и Т3. Не было обнаружено таких изменений и в другом исследовании (Singh et al., 2000) на 58 мужчинах из числа персонала заправочных станций и мастерских техобслуживания автомобилей, которые по роду своих занятий получают значительные дозы свинца. С другой стороны, по сообщению Robins et al. (1983), у людей, получавших значительные дозы свинца, отмечено снижение содержание в плазме крови Т4 и свободного Т4. Dundar et al. (2006), изучавшие последствия долгосрочного отравления малыми доза свинца молодых пациентов, сообщали о наличии отрицательной корреляции между концентрациями в плазме крови свинца и свободного Т4, тогда как по концентрациям ТСГ и Т3 изменений отмечено не было. В другом исследовании сообщалось о повышении по сравнению с контролем уровня свободного Т3 и снижении уровня ТСГ в группе пациентов с отравлением свинцом (Yılmaz et al., 2012). Сообщалось также, что когда концентрация свинца в плазме крови превышает уровень 52 мкг/дл, он запускает секрецию ТСГ гипофизом (Singh et al., 2000). В исследованиях на рабочих с отравлением свинцом, как и в нашем опыте, отмечалось повышение концентрации в плазме ТСГ (Gustatson et al., 1989; Lopez et al., 2000).

Свинец может вызывать дегенеративные изменения, сателлитоз, вакуолизацию нейронов, нейронофагию, воспалительные изменения и дегенеративные расстройства нервной системы, инфильтрацию воспалительных клеток и вакуолизацию цитоплазмы в печени и почках (Taib et al., 2004; Ozsoy et al., 2011; Shalan et al., 2005). В нашем исследовании было отмечены дегенеративные изменения, инфильтрация воспалительных клеток, пролиферация интерстициальной соединительной ткани, что свидетельствует о гипотиреоидизме (Рис. 2).

Для лечения отравления свинцом использовались многие средства, включая витамин С и L-карнитин (Shaban El-Neweshy and Said El-Sayed, 2011; Flora et al., 2003). Сообщалось, что ГК могут смягчать изменения в секреции тиреоидных гормонов и действовать как иммуномодуляторы (Laurberg et al., 2003). Обилие функциональных групп в молекулах ГК придает им разнообразные функциональные свойства, включая способность связывать тяжелые металлы за счет образования хелатных комплексов (Schnitzer and Khan, 1972). В нашем исследовании параллельный со свинцом ввод в рацион кур ГК позволил частично скомпенсировать снижение потребления корма и яйценоскости (на 17,7 и 23,8% соответственно; данные в таблицах не представлены) и снизить концентрацию свинца в плазме на 16,4% (Табл. 1) по сравнению с группой, получавшей только свинец. Кроме того, параллельный ввод свинца и ГК снизил концентрацию в плазме ТСГ до нормального уровня (Табл. 1), что может объясняться защитным эффектом ГК в отношении паренхимальных клеток ЩЖ. Помимо способности хелатировать тяжелые металлы, ГК также обладают противовоспалительным действием. При параллельном вводе в рацион свинца и ГК в тканях ЩЖ отмечены изменения, аналогичные симптомам отравления свинцом, однако выраженные в меньшей степени (Рис. 3).

В заключение отметим, что у несушек, подвергнутых экспериментальному отравлению свинцом, концентрации свободных Т3 и Т4 в плазме крови не отличались от контроля, тогда как концентрация ТСГ повышалась на 167%. При параллельном вводе в рацион со свинцом ГК концентрации свинца и ТСГ в плазме крови частично (по свинцу) и полностью (по ТСГ) нормализовались, а гистологическое исследование ЩЖ показало, что дегенеративные изменения, вызванные свинцом, исчезли. Полученные в нашем опыте результаты свидетельствуют о том, что гуминовые кислоты способны связывать тяжелые металлы и могут способствовать структурному и функциональному восстановлению щитовидной железы.